Animal Models Advance Research on Prion Diseases and Tauopathies

Summary

Sources

jci.orglink.springer.com

Использование животных моделей является важным инструментом для изучения нейродегенеративных заболеваний, таких как прионовые болезни и тауопатии. Эти модели позволяют ученым воспроизводить и исследовать механизмы заболеваний, что способствует разработке новых методов лечения и диагностики. В этом эпизоде рассматриваются два основных исследования. Первое исследование связано с созданием мышей с нокаутом гена для изучения прионовых болезней. Эти мыши были разработаны с использованием технологии CRISPR/Cas9 для внесения специфических мутаций в ген прионового белка. Второе исследование направлено на создание трансгенных крыс, которые моделируют человеческие тауопатии. Эти крысы несут человеческий тау-белок с мутацией MAPT P три ноль один S, что позволяет изучать патогенез и прогрессию тауопатий. Для создания мышей с нокаутом гена, использующихся для изучения прионовых заболеваний, применялась технология CRISPR/Cas9. В этом исследовании использовались плазмиды, содержащие открытые рамки считывания (ORF) либо дикого типа (WT), либо мутантных форм D178N или E200K прионового белка. Эти конструкции были вставлены между сайтами EagI и ClaI промежуточного вектора, содержащего гомологичные регионы и неомициновую кассету селекции, которую можно удалить с помощью фермента Flp рекомбиназы. Процесс генерации нокаутных мышей включал в себя несколько этапов. Сначала генетически отредактированные эмбриональные стволовые клетки объединялись с диплоидными эмбрионами мышей. Химерные мыши идентифицировались по их смешанному окрасу шерсти и затем скрещивались с мышами линии B6-альбино, чтобы выявить те, которые прошли через герминативную передачу. После этого химерные мыши скрещивались с линией Flp-делетор для удаления кассеты селекции, а затем с мышами дикого типа для удаления трансгена Flp. Мыши, положительные на нокаутный аллель и отрицательные на трансген Flp, затем скрещивались, чтобы создать гомозиготных нокаутных мышей. Мыши содержались группами по четыре-пять животных в клетке на цикле двенадцать часов света/двенадцать часов темноты с неограниченным доступом к пище и воде. Они регулярно оценивались на предмет появления спонтанных признаков неврологического заболевания, таких как потеря веса, агрессия, атаксия, подергивание головы, судороги, круговые движения, кифоз, паралич конечностей, ригидность хвоста, брадикинезия, пустой взгляд и тремор. Мыши, у которых проявлялись два или более симптомов, оценивались ежедневно и эвтаназировались при переходе к конечной стадии заболевания. Значимость этих моделей заключается в возможности изучения прогрессии прионовых заболеваний. Это включает оценку неврологических симптомов и патологии мозга. Мозг заболевших мышей либо замораживался для дальнейшего анализа, либо фиксировался в формалине для гистологического исследования. Эти модели позволяют детально изучать механизмы прионовых заболеваний и разрабатывать потенциальные терапевтические подходы. Процедуры для анализа передачи прионов в нокаутных мышах включают несколько ключевых этапов. Одним из основных методов является внутрицеребральная инокуляция. Мыши, приблизительно шестинедельного возраста, подвергались анестезии с использованием изофлурана, после чего им вводили 30 микролитров одного процента мозгового гомогената, разведенного в фосфатно-солевом буфере с пятью процентами белка бычьего сывороточного альбумина. Инокуляцию проводили в правое полушарие мозга на глубину около трёх миллиметров с помощью иглы. После инокуляции мышей содержали в одноразовых клетках группами по три-четыре особи и мониторили развитие неврологических заболеваний. При достижении конечной стадии болезни мыши подвергались эвтаназии, и их мозг извлекался для дальнейшего анализа. Левое полушарие замораживали и хранили при минус восьмидесяти градусах Цельсия, тогда как правое фиксировали в десятипроцентном нейтрально-буферном формалине для гистопатологического исследования. Для анализа уровней прионового белка использовались методы гомогенизации мозга и экстракции детергентом. Замороженные полушария мозга гомогенизировали в десятипроцентном растворе фосфатно-солевого буфера с использованием гомогенизатора. Затем для экстракции белка к гомогенату добавляли детергентный буфер и инкубировали на льду с периодическим встряхиванием. Полученные образцы центрифугировали для отделения супернатанта, который затем анализировали с помощью биохимического анализа БКК. Иммуноблоттинг применялся для дальнейшего анализа уровней прионового белка. Белки разделяли на десятипроцентных гелях и переносили на мембраны из поливинилидендифторида. Мембраны блокировали в растворе сухого молока, а затем инкубировали с первичными и вторичными антителами. Развитие сигнала проводилось с использованием химилюминесцентных субстратов и детекцией методом экспозиции на рентгеновской пленке или с использованием сканера LI-COR Odyssey. Для детекции и количественного анализа распространения и стабильности прионов использовались методы RT-QuIC и конформационной стабильности. В RT-QuIC реакциях использовали рекомбинантный прионовый белок, который инкубировали с образцами мозгового гомогената в присутствии тиофлавина Т. Флуоресцентные показания измеряли с помощью микропланшетного ридера, что позволяло выявить наличие и количество прионовых агрегатов. Конформационные стабильностные тесты включали инкубацию образцов с градиентом концентрации гуанидингидрохлорида, что позволяло оценить устойчивость прионовых агрегатов к денатурации. Эти методы позволяют не только выявлять прионовые белки, но и оценивать их количественные и качественные характеристики, что является важным для понимания механизмов передачи и патогенеза прионовых заболеваний. Создание трансгенной линии крыс Tg12099 направлено на моделирование человеческих тауопатий. Для этого была разработана конструкция, использующая промотор прионового белка крысы для сверхэкспрессии человеческого тау-изоформа 0N4R с мутацией MAPT P три ноль один S. Эта конструкция была микроинъецирована в эмбрионы крыс линии Спрэг-Доули, что привело к созданию линии Tg12099, содержащей от двадцати одной до двадцати двух копий трансгена. Для генетической и фенотипической характеристики этих крыс использовался метод TLA для картирования сайтов вставки трансгена. Было выявлено, что в линии Tg12099 трансген вставлен в восемнадцатую хромосому крысы без нарушения кодирующих последовательностей генов и без структурных перестроек в локальном геноме. Иммуноокрашивание с использованием моноклонального антитела Tau тринадцать показало, что у взрослых крыс Tg12099 наблюдается повсеместная экспрессия человеческого тау-белка в центральной нервной системе, включая гиппокамп, гипоталамус, таламус и различные корковые области. Фенотипическая характеристика крыс Tg12099 показала значительные неврологические дефициты и сокращение продолжительности жизни. Крысы Tg12099 с гомозиготной экспрессией трансгена (Tg12099 плюс/плюс) продемонстрировали более высокие уровни экспрессии тау-белка и более выраженные неврологические симптомы, такие как атаксия, брадикинезия и судороги, по сравнению с гетерозиготными (Tg12099 плюс/минус) и дикими (WT) крысами. Средняя продолжительность жизни гомозиготных крыс составляла четырнадцать месяцев, тогда как гетерозиготные крысы могли жить более двадцати четырех месяцев. Эти модели позволяют детально изучать механизмы развития и прогрессии тауопатий, что важно для поиска новых терапевтических стратегий. Нейропатологический и биохимический анализ крыс Tg12099 плюс/плюс выявил значительное очаговое нейродегенеративное поражение, утрату нейронов и глиоз в корковых и лимбических системах. Эти изменения наиболее выражены в пираторной коре и миндалевидном теле, где наблюдаются значительные атрофические процессы и увеличение объемов желудочков. Одним из ключевых маркеров патологии в этих крысах является гиперфосфорилирование тау-белка, что ведет к образованию нейрофибриллярных клубков (NFTs). Иммуноокрашивание с использованием антител, таких как AT8, PHF-1 и Tau13, продемонстрировало наличие гиперфосфорилированного тау в нейронах и нейропиле. Эти белковые агрегаты были выявлены в основном в клеточных телах нейронов и окружающей их ткани в таких областях, как гиппокамп, кора и миндалевидное тело. Биохимические тесты, такие как экстракция с использованием детергентов и иммуно-блоттинг, показали, что гиперфосфорилированный тау-белок становится нерастворимым в саркозиле, что является характерной чертой патологических изменений. Такие методы, как RT-QuIC и конформационные стабильностные тесты, позволили оценить распространение и стабильность прионовых агрегатов тау-белка. Использование различных антител, таких как AT8 для выявления гиперфосфорилированного тау и NeuN для идентификации нейронов, а также окрашивание на глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) для выявления активированных астроцитов, позволило детально охарактеризовать тау-патологию и распространение прионов в этих моделях. Эти находки подчеркивают важность гиперфосфорилирования тау и формирования нейрофибриллярных клубков в развитии нейродегенеративных процессов, что делает модели Tg12099 плюс/плюс важным инструментом для дальнейшего изучения тауопатий и разработки новых терапевтических подходов.